Nowa metoda pozwala śledzić aktywność genetyczną żywych komórek bez ich niszczenia

Badacze z Broad Institute i MIT opracowali metodę do wielokrotnej analizy aktywności genetycznej żywych komórek za pomocą cząsteczek podobnych do wirusów, które eksportują RNA, bez niszczenia próbek.

Metoda ta pozwala na wielokrotne pobieranie próbek RNA z tej samej populacji komórkowej i obserwowanie, jak zmienia się ona w czasie. Technika ta działała w komórkach ludzkich, nowotworowych, macierzystych, neuronowych, pierwotnych oraz w modelach trójwymiarowych.

Badacze z Broad Institute MIT i Harvard oraz z Massachusetts Institute of Technology opracowali metodę, która pozwala na śledzenie aktywności genetycznej żywych komórek przez kolejne okresy, bez konieczności ich niszczenia w celu uzyskania dostępu do RNA. Postęp ten ma na celu rozwiązanie centralnego ograniczenia konwencjonalnej transkryptomiki: każda analiza zazwyczaj oferuje izolowane zdjęcie, ponieważ komórka musi zostać zniszczona podczas przygotowywania próbki.

Technika, opisana w czasopiśmie Cell, przekształca same komórki w rodzaj systemu autoinformacyjnego molekularnego. Zamiast fizycznie wydobywać materiał genetyczny, badacze projektują je tak, aby pakowały część swojego RNA w cząsteczki podobne do wirusów i uwalniały je do medium hodowlanego, gdzie mogą być zbierane i sekwencjonowane.

Możliwość ta jest szczególnie istotna do badania procesów, które zmieniają się w czasie, takich jak dojrzewanie komórkowe, reakcja na zakłócenie czy działanie leku. Próbka medium może być wielokrotnie pobierana, dzięki czemu naukowcy mogą porównywać różne momenty tej samej populacji i rekonstrukować, jak ewoluuje ich aktywność genetyczna.

Prace prowadził Mohamad Najia i Jacob Borrajo, wraz z główną współautorką Anną Le, badaczką podoktorancką w laboratorium Paula Blaineya. Blainey, główny członek Broad i profesor inżynierii biologicznej w MIT, brał udział w rozwoju projektu, który miał na celu stworzenie użytecznych narzędzi dla innych grup badawczych. Zespół uznał, że urzeczywistnienie tego pomysłu stanowiło rezultat projektu wysokiego ryzyka rozpoczętego ponad dekadę temu.

Podstawą systemu jest inspiracja retrovirusami, które ewoluowały zdolność do otaczania swoich genomów RNA białkowymi powłokami, aby przemieszczać je między komórkami. Zespół zaprojektował komórki ssaków, aby wyrażały białko strukturalne retrowirusa zdolne do rekrutacji RNA komórkowego, formowania powłoki wokół tego materiału i odrywania się od błony do płynu otaczającego komórkę.

Po uwolnieniu cząsteczek naukowcy muszą jedynie pobrać próbkę medium hodowlanego, wyizolować RNA i sekwencjonować je. Wynik oferuje reprezentację transkryptomu populacji komórkowej bez konieczności stosowania procedur, które ją niszczą lub w znaczący sposób zmieniają jej najbliższe otoczenie.

Propozycja ta ma na celu przezwyciężenie ograniczeń alternatyw opartych na robotyce, biopsjach mechanicznych lub indywidualnej manipulacji komórkami, które mogą być trudne do skalowania w zwykłych laboratoriach. Mohamad Najia wyjaśnił, że rozwiązanie zakodowane molekularnie mogłoby ułatwić badanie dynamicznych i czasowych pytań w laboratoriach nauk przyrodniczych i badań biomedycznych.

System wciąż nie odpowiada idealnemu odczytowi każdej pojedynczej komórki, ponieważ uzyskane sygnały odpowiadają głównie analizowanej populacji. Jednak zespół Broad pracuje nad dostosowaniem podejścia do badania pojedynczych komórek, co mogłoby zwiększyć rozdzielczość metody i pomóc w odróżnieniu subpopulacji o różnych zachowaniach.

Aby ocenić zakres techniki, badacze przetestowali ją na ludzkich komórkach nieśmiertelnych, liniach komórkowych nowotworowych, komórkach macierzystych oraz komórkach neuronowych pochodzących z tych ostatnich. Wykorzystali również komórki pierwotne pozyskane od dawców ludzkich, co pozwoliło sprawdzić, że system nie był ograniczony do modeli komórkowych w laboratoriach o bardzo specyficznych cechach.

Zespół jednocześnie hodował dwa rodzaje ludzkich komórek i używał znaczników w cząstkach podobnych do wirusów, aby odróżnić sygnały z każdej populacji podczas analizy. Ta zdolność mogłaby pomóc w badaniu interakcji między komórkami, pod warunkiem że badacze będą mogli wyraźnie zidentyfikować źródło RNA, które dociera do medium.

Kolejna demonstracja została przeprowadzona na sferoidach ludzkich komórek śródbłonkowych, trójwymiarowych strukturach, w których architektura przestrzenna może być istotna dla interpretacji aktywności genetycznej. Po stymulacji biochemicznej metoda pozwoliła na uchwycenie krótkoterminowych zmian transkrypcyjnych bez demontażu modelu w celu wydobycia jego komórek.

Badacze współpracowali również z Lindą Griffith, profesorem inżynierii biologicznej i mechanicznej w MIT, aby przetestować system w urządzeniach typu organ-on-a-chip. W tych modelach, autoinformacja komórkowa pozwoliła na monitorowanie w czasie ekspresji genów związanych z formowaniem sieci naczyniowych, których zmiany zależały od tego, czy fibroblasty wspierające pochodziły z macicy, czy z płuc.

Urządzenia typu organ-on-a-chip mają na celu naśladowanie aspektów fizjologii ludzkiej i mogą przyczynić się do zmniejszenia potrzeby przeprowadzania testów przedklinicznych lub eksperymentów z modelami zwierzęcymi. Niemniej jednak ich złożoność utrudnia wydobycie komórek bez zakłócania struktury urządzenia, dlatego narzędzie, które zbiera sygnały z medium, mogłoby dostarczyć informacji bez demontażu systemu.

Ten sam zasadniczy mechanizm mógłby służyć do obserwacji, jak populacja komórkowa reaguje na leki, stres biologiczny lub sygnały dojrzewania. Zamiast porównywać zniszczone próbki pochodzące z różnych grup, badacze mogliby śledzić kolejno zachodzące zmiany w populacji i powiązać je z dokładnym momentem interwencji.

Technika ta oferuje również drogę do badania chorób, w których ewolucja czasowa jest kluczowa, chociaż komunikat nie przedstawia jeszcze zastosowania klinicznego ani nie twierdzi, że metoda jest gotowa do użycia u pacjentów. Jej wyniki odpowiadają demonstracjom eksperymentalnym w systemach komórkowych i modelach laboratoryjnych, dlatego konieczne będzie zbadanie jej precyzji, stabilności i zachowania w bardziej złożonych kontekstach.

Laboratorium Blainey nadal poszukuje nowych zastosowań biologicznych i pracuje nad tym, aby uczynić badanie pojedynczych komórek wykonalnym. Na razie postęp ten proponuje inny sposób rozumienia transkryptomiki: zamiast zmuszać komórkę do ujawnienia swojej zawartości poprzez jej zniszczenie, pozwala jej okresowo wysyłać sygnał molekularny o tym, co dzieje się wewnątrz niej.